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神奇的环状DNA纳米世界
生物技术
2018-04-16 14:00
作者  梁兴国 安然 崔一笑 吴昊天 成语

DNA不仅仅是遗传信息的载体,也是一种构建纳米结构的材料。不同的DNA纳米材料可呈现“网笼”“链锁”等形状,也可以制成纳米机器,用于药物载体、物质运输、液体计算等方面。在利用拓扑结构构建纳米结构时,DNA环化及连环的构建是关键基础技术。 

什么是DNA环化?

这里的DNA环化是指单链DNA分子首尾相互连接成环状。通常的成环方法是使在DNA夹板链的辅助作用下用DNA连接酶连接成环,即线性DNA(成环链)同一条与其两端部分互补的DNA夹板链(splint)杂交,形成切口(nick)结构,经DNA连接酶连接使成环链两端闭合(见图1A)。然而,在成环的过程中有一个问题难以解决,成为制约相关研究的瓶颈,即连接后会生成线状或环状的二聚体。有时候,即使在低于0.5微摩尔/升的稀溶液中也会发生分子间的副反应。这就像很多在水中游动的小蛇咬自己尾巴(分子内)上的美食,总会有蛇会咬到别的蛇的尾巴(分子间),而且蛇越多越密集就越容易咬到。很明显,这一反应浓度越低越有利,但浓度低不利于大量制备。

图1.jpg

如何高效获得环状DNA?

中国海洋大学梁兴国教授于2004年开始研究DNA的环化以及DNA连环的拓扑结构。持续的努力终于得到了回报,2017年他找到了解决这一问题的关键,即采用异常稀释的缓冲溶液以及逐步滴加法(图1B),可以获得高达30微摩尔/升的较高纯度的环状DNA。有意思的是,采用使连接效率降低的稀释20倍的缓冲溶液(0.05×Buffer)起到了意想不到的效果。这一成果发表在国际知名学术期刊《核酸研究》(Nucleic Acid Res)上,梁兴国教授也应邀在2017年11月举办的第44届国际核酸会议上做了相关的学术报告。这一方法因打破常规,而且简便可行,得到了相关领域的多名专家的认可。

比较逐次加入法(1×Buffer)与传统一次法(0.05×Buffer)成环的效果(见图2),逐次加入法成环不仅将环状DNA的产率大大提高,还将成环浓度提升至了30微摩尔/升,收率高达64%。这一思路对如何调节分子间与分子内反应的平衡有很高的参考价值。

图2.jpg

单链环状DNA的应用

环状DNA可以不被DNA外切酶破坏,而且如果两环或多环相连,可以制备成多种拓扑结构,在DNA纳米结构构建中有很广泛的应用。中国海洋大学的“海之子”(Season)团队在梁兴国教授的指导下,以单链环状DNA作为构建DNA纳米材料的基本元件,构建了各种纳米结构,并自2014年开始参加国际生物分子设计大赛(BIOMOD)。BIOMOD由美国哈佛大学维斯学院(Wyss Institute at Harvard University)于2011年创办,是核酸化学与纳米技术领域的世界顶级赛事。以本科生为主的Season团队在食品科学与工程学院核酸化学与生物技术实验室刻苦攻关,取得了1金奖、2银奖、1铜奖的优异成绩。

(1)DNA三环互锁与DNA奥运五环

图3.jpg

理想的DNA连环的构建必须满足各个环之间的连接只缠绕1圈的条件(Lk = 1,DNA在DNA双螺旋中,每经过10.5个碱基对,两条链相互缠绕1圈)。而这一要求很难达到。当两个环互补部分较长或控制不严时,易产生缠绕2圈(Lk = 2);当互补部分较短时,会降低杂交效率,难以形成连环(Lk = 0)。研究团队巧妙地加入了较长的脚手架(scaffold),让两个互补部分只有8个碱基的线性DNA,共同与scaffold杂交,将原来分子间的8碱基的杂交变为分子内的杂交。这样就能大大提高只有8碱基互补的两条链的杂交效率,即在保证Lk = 1的情况下,提高了连环形成的效率。图3和图4表示了利用这一原理构建的DNA三环互锁和DNA奥运五环的示意图和原子力显微镜结果,构建效率大大提高。

QQ图片20180416131903.jpg

(2)行走的DNA分子机器人

许多科技工作者致力于构建可以行走的DNA分子机器人(DNA walker),但作为一种分子级别的运输系统,其运输路径的刚性和布朗运动的随机性限制了其在实际中的应用,并且运输过程既需要燃料链又不易重复进行。在实验中,同学们受到驱动蛋白运动形式的启发,设计了一个类似驱动蛋白的分子机器人;同时以三螺旋DNA为基础增强刚性,以DNA连环为轨道,利用酶反应和热力学控制其行进时间。每当行走至一个位点,限制酶便会切割结合域,使分子机器人脱离并前往下一个位点(见图5)。更为巧妙的是,在运动完成后。该行走系统可以通过加入DNA连接酶来重置整个系统。

图5.jpg

(3)Z-B chimera

在一般条件下右螺旋DNA(B-DNA)较左螺旋DNA(Z-DNA)稳定,很难获得生理条件下稳定的左螺旋DNA,这大大限制了相关研究的顺利进行。本研究运用拓扑学原理,使两个完全互补的单链环状DNA分子杂交,以生成缠绕同样圈数的左螺旋和右螺旋共存的特殊结构(LK = 0),研究团队将其称为Z-B杂合体(Z-B chimera,见图6)。该研究的意义在于获得了在生理条件下稳定存在的左螺旋DNA,突破之前只有在嘌呤嘧啶交替序列和高盐浓度或碱基甲基化等特殊条件下才能形成左螺旋DNA的限制。研究团队还发现Z-B chimera 具有转录的能力,在设计的序列中加入启动子序列后,Z-B chimera 可以顺利地转录出RNA的重复序列,显示了其在研究体内左螺旋DNA功能方面的巨大潜力。

图6.jpg

(4)大型DNA锁环

形成多个连环相连的网状结构(DNA hauberk)一直是研究团队的一个梦想。图7为研究团队设计的基本结构,由一条长链和ABCD四种环组成,奇数层为AB交替排列,偶数层为CD交替排列,以此规律制备无限延伸的结构。在长链和环的结合域长度、铰链长度、加入互补短链控制拓扑结构、splint的位置等方面进行了探讨。研究团队发现,合成DNA锁环时,针对暴露的单链添加互补短链可减少错误缠绕,使产物Lk为1;环与长链序列中与其他环结合域之间的铰链长度要适当,如果太短,空间位阻会降低产率,如果过长,则会降低链缠绕的几率,造成连环的产率降低。

图7.jpg

目前,研究团队的DNA成环及连环技术正快速发展,同时不断创新环状DNA的应用。未来研究团队将在构建DNA纳米材料的基础上,使环状DNA携带具有生物功能的核酸片段,拓展其在医药、食品溯源、分子检测等领域的广泛应用。 

作者:梁兴国、安然、崔一笑、吴昊天、成语

(梁兴国,教授、博士生导师,中国海洋大学食品科学与工程学院副院长。入选国家“青年千人计划”,山东省“泰山学者”海外特聘教授、中国海洋大学“筑峰人才工程”特聘教授。研究领域为核酸化学与核酸生物技术,主要从事核酸化学,食品中核酸的定性定量检测,食品用核酸纳米材料,以及核酸的代谢及营养作用等方面的教学及科研工作;安然,中国海洋大学讲师;崔一笑,中国海洋大学博士研究生;吴昊天,中国海洋大学本科生;成语,中国海洋大学本科生。

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